發稿時間：2020-06-12 來源：凡默谷
摘要
本文結合近期國內新注冊分類和一致性評價的相關技術要求，在《制備工藝和過程控制對合成多肽藥物有關物質的影響》和《合成多肽藥物質控及雜質譜研究》基礎上，對多肽類仿制藥研發和一致性評價應重點關注的問題進行了探討，以期幫助新藥研發人員提高申報資料質量。
關鍵詞
多肽; 仿制藥; 一致性評價; 研究與開發
正文
隨著多肽合成工藝的成熟和藥物制劑技術的提高，多肽類藥物已成為國內外藥物研發公司關注的重點。在2017 年度FDA 批準的46 個新藥中，有6 個為多肽類藥物［1］，為多肽類藥物年批準數量的歷史新高，證明多肽類藥物開發已進入“快車道”。
我國多肽類藥物開發起步較晚，原料藥的可及性、高端制劑的技術瓶頸等都制約了多肽類藥物的發展。隨著重大新藥創制專項和生物醫藥產業“十二五”規劃的重點扶持，近幾年多肽類藥物技術難點有了重大突破，國內多肽類藥物申報數量逐漸提高。但由于技術實力差異和多肽類藥物開發指導性文件的不完善，申請人遞交的申報資料質量參差不齊，部分遞交資料存在嚴重缺陷，影響了此類產品的研制和注冊申報。針對上述情況，本作者曾發表2篇文獻［2 － 3］，結合國內外相關技術指導性文件，對多肽類藥物原料藥的合成工藝、質量標準、雜質研究等方面進行了探討。
本文結合國家藥品監督管理局發布的《關于藥品注冊審評審批若干政策的公告》( 2015 年第230號) 、《關于仿制藥質量和療效一致性評價工作有關事項的公告》( 2017 年第100 號) 、《化學藥品注射劑仿制藥質量和療效一致性評價技術要求( 征求意見稿) 》等相關政策文件的要求，對已上市多肽類藥物存在的問題進行了回顧，并對該類藥物在一致性評價、仿制藥申請中應關注的問題進行探討。
1.我國多肽類藥物現狀?
多肽類藥物在我國近幾年的銷售額均保持比較快速的增長態勢，其中奧曲肽、生長抑素、曲普瑞林、亮丙瑞林等品種銷售額均過億元。但我國可自主生產的多肽類藥物產品初級、附加值低。目前，多數市場前景廣闊的藥物仍主要依靠進口，如胰高血糖素樣肽-1( GLP-1) 類似物等，見表1。
表1 部分列舉了2000 年之后在歐、美、中國上市的多肽類藥物，在腫瘤、抗感染、糖尿病、免疫等治療領域有較多的多肽類藥物上市。通過對比可見，多數藥物在我國的上市時間晚于歐美，部分專利過期且療效確切的藥物，在國內尚無仿制品上市或僅有少數企業仿制生產。
可能存在多種原因:?
① 原料藥的可及性。目前，國內具備商業化生產高質量多肽原料藥能力的企業較少，且具有原料藥生產能力企業所生產的原料藥多數僅供本公司制劑使用，市場上能購買到藥用級別高質量的原料藥較少，在源頭上限制了多肽類藥物的發展。
② 關鍵制劑技術尚需突破。部分特殊多肽制劑，如緩釋微球、脂質體、吸入制劑等劑型，現國內掌握上述制劑核心技術的企業較少，從另一方面制約了該類多肽藥物的上市。
③ 研發企業的關注度。由于多肽類藥物是介于大分子蛋白藥物和小分子化學藥物之間的一類特殊藥物，其研發、生產均具有一定的特殊難度。國內大多數制藥企業未涉獵過此類藥物，對該類藥物的關注度較低，因此導致仿制數量比小分子化學藥物低很多。如化學小分子藥物帕瑞西布鈉，專利過期后，即有數十個企業申報生產，而多肽類藥物特利加壓素專利早已過期，目前國內僅有個別仿制藥企業獲準生產。
國內部分已上市的多肽類藥物上市時間較早，近年我國成為ICH 成員國，藥品的技術標準與國際接軌，隨著我國藥品一致性評價工作全面展開，早期上市的多肽類藥物可能無法滿足一致性評價技術要求，已有生產批準文號的多肽生產企業將面臨巨大的挑戰。
2.參比制劑的確定
按照我國藥監機構發布的法規文件，仿制藥品應與參比制劑保持質量和療效一致。中共中央辦公廳、國務院辦公廳于2017 年發布《關于深化審評審批制度改革鼓勵藥品醫療器械創新的意見》，明確要求我國應逐步建立橙皮書制度，明確各藥品的參比制劑。
由于仿制藥橋接了參比制劑質量控制、安全性有效性信息，申請人在開發多肽仿制藥時，應高度重視參比制劑的選擇。除了參考《關于發布化學仿制藥參比制劑遴選與確定程序的公告》( 2019 年第25號) 以外，還應該對產品在國外上市時制劑處方合理性、臨床試驗規范性科學性、說明書的權威性等進行全面考察。以注射用縮宮素為例，分享參比制劑選擇時在藥學方面的一些考慮。
在美國、歐洲和日本上市的縮宮素注射液，均有獲得國內參比制劑資格的可能性，如美國App Pharmaceuticals，LLC、歐洲Mylan Products Ltd、日本武田薬品工業株式會社等公司產品。對于仿制注射劑，原則上Q1，Q2 與參比制劑一致，即處方中輔料種類和用量一致; 其次《化學藥品注射劑基本考慮( 試行) 》要求，在滿足需要的前提下，注射劑所用輔料的種類及用量應盡可能減少。
處方中是否含有乙醇是歐洲、美國、日本上市產品處方組成的主要差別。日本、美國上市產品中不含乙醇，歐洲上市產品中含有乙醇，同時檢索發現歐洲近期批準產品中也不含乙醇，因此需對處方中乙醇的作用以及存在必要性進行詳細分析，并結合產品上市前臨床研究和說明書等信息明確參比制劑。
3.多肽原料藥質量
多肽原料藥質量控制相對復雜，在《制備工藝和過程控制對合成多肽藥物有關物質的影響》和《合成多肽藥物質控及雜質譜研究》中闡述了如何結合保護氨基酸質量控制、縮合過程控制、純化控制、中間體控制等綜合實現多肽類藥物的質量控制［2 － 3］。
在此需要明確合成多肽藥物的過程控制更為重要，是多肽類仿制藥申請和一致性評價申請提升質量的重點。在全面研究的基礎上，才可能實現對多肽類藥物的充分質控，僅靠檢測手段可能無法有效評估產品質量，以下分享2 個可能引起多肽類藥物質量風險的實例。
對于小分子化學藥，合成路線不同造成雜質譜的差異有限，經過相應的分析及研究基本可全面覆蓋潛在雜質譜的差異。多肽類藥物不同于小分子化學藥，其合成路線較多，同一條肽鏈可以利用固相合成、液相合成、固相液相結合的片段合成等手段制備，即合成路線選擇較多，造成工藝雜質與參比制劑存在較大差異。從目前申報資料上看，國內基本采用從C 端到N 端逐步偶聯的手段制備，而多數國外原研企業采用固相合成制備多肽片段，再偶聯成整條肽鏈。
暫且不分析合成路線合理性問題，但不同合成路線可能導致雜質譜存在較大差別。以美國藥典收載的艾塞那肽為例，盡管藥典收載的有關物質分析方法多達3 種，但有部分申請人開發之后仍發現藥典收載方法存在不可檢出的工藝雜質。藥典收載的方法可能主要源于原研品方法，由于仿制企業采用的合成路線不同，所產生的雜質譜不一致。
僅采用藥典或原研進口注冊標準的有關物質分析方法可能無法全面揭示仿制藥雜質水平，進而導致產品質量存在風險。因此，對于多肽類藥物需進行詳細的雜質譜分析并采用相應的雜質對照品對分析方法的檢出能力進行全面驗證，僅采用已有的分析方法進行考察，很可能造成雜質漏檢等質控缺陷。
對于雜質含量方面，需要注意某些雜質即便滿足安全水平范圍，但也可能對多肽藥物的穩定性存在較大影響。比如，某多肽類藥物收載于《中華人民共和國藥典》，藥典對有關物質的要求為最大未知單雜不得過2.0%。在審評過程中發現按藥典收載方法檢測，參比制劑主峰后為單一雜質峰，多數國產制劑主峰后存在2 個雜質峰，其中1 個雜質峰與參比制劑雜質峰相對保留時間相同，應該為同一雜質，多出的雜質峰為新增未知雜質。
雜質含量未超過最大未知單雜的控制限度要求。盡管初始雜質水平較低且符合藥典要求，但在穩定性考察過程中，新增的未知雜質增長較快，12 個月后已接近控制限度要求，而參比制劑主峰后仍基本維持一個雜質峰。分析該雜質可能是酰胺類水解雜質，在體系內殘留的少量雜質可能發生類似“鏈引發”反應，造成仿制產品的雜質增長水平遠高于參比制劑。
4.多肽類藥物的結構
結構是基礎，如果結構上存在差異，仿制產品的活性可能弱于參比制劑，甚至沒有活性。多肽類藥物結構確證與小分子藥物存在較大差別，可能具有高級結構，常用可以反映多肽藥物結構的方法如下。
一級結構確證方法: 可以采用質譜測定其分子量，用質譜結合酶切進行肽序的鑒定，或者采用Edman 降解進行肽序的鑒定。
二級結構確證方法: 多肽二級結構實際上是肽鏈因氫鍵而形成的局部結構，研究手段有X-射線單晶衍射、二維NMR、FT-IR 及遠紫外CD 等方法。其中X-射線單晶衍射及二維NMR 測的最為準確，但多肽的單晶不易培養，而且不代表溶液中的真實情況，而二維NMR 耗時長、解析困難，并且分析通量低，所以這2 種方法一般用得較少; 目前采用最多的是FT-IR 與遠紫外CD 法。
三級結構確證方法: 對于復雜多肽可能有三級結構存在，三級結構研究常用的方法有熒光光譜及近紫外CD 等，其原理是利用芳香氨基酸側鏈的微環境變化帶來熒光發射光譜和近紫外CD 譜的差異。但該方法目前只能進行定性對比研究，無法進行明確的結構確證，只能作為三級結構研究的參考。
四級結構確證方法: 多肽及蛋白功能性聚集是高級結構的一種反映，它包含兩方面信息: 聚集單體的數量和聚集后的空間構象。常用的分析方法包括場流分離、超速離心。
生物活性研究方法: 由于高級結構確證可能存在一定的不確定性，可通過測試生物活性間接證明多肽類藥物高級結構的正確性。如表2 所統計已收入美國藥典的11 個多肽類藥物有4 個制劑和1 個原料藥需要測定生物活性，越來越多的多肽類藥物需要增加生物活性的研究和檢測。
目前，對于多肽及蛋白的活性研究有體外( invitro) 及體內( in vivo) 2 種路徑。in vitro 評價方法包括但不限于酶動力學、結合力測定、生物活性測定;其中酶動力學測定采用酶促反應; 結合力測定，如果是分子之間采用表面等離子共振技術( SPR) 、生物膜層干涉技術( BLI) 以及微量差示掃描量熱技術( NanoDSC) 等技術完成，如果是和細胞表面的受體結合一般采用均相時間分辨熒光等技術完成; 生物活性一般采用藥物刺激細胞，采用均相時間分辨熒光等技術檢測其產生的化學物質來完成［4］。in vivo評價一般采用動物或動物器官，如機理明確則檢測具體某種化合物指標，如不明確則觀察具體的治療效果。例如可采用小鼠的EAE 模型來評價醋酸格拉替雷對多功能硬化癥的癥狀延遲及減輕效果［5］。
對于多肽類藥物而言，結構確證部分不同于小分子化學藥物。小分子化學藥物一般在原料藥部分明確結構后，制劑開發中可不用進一步研究。而多肽藥物由于高級結構的不確定性，部分需要在制劑中與參比制劑進行對比研究，以確定某一結構含量與參比制劑的一致性。同時，由于多肽類藥物高級結構與其所處環境有關，在結構測試過程中可能脫離藥物實際使用環境，因此有必要采用多種相互補充的分析方法對比研究仿制品與參比制劑結構的一致性。
在此需要明確，并不是所有多肽類藥物都存在高級結構，在合成中存在高級結構的藥物僅占少數。在此建議產品開發者先通過參比制劑信息、文獻、專利等方面綜合檢索，明確是否存在高級結構，再選擇適合的結構確證手段進行研究，避免過度開發。
5.多肽制劑研究?
多肽類藥物制劑絕大多數為注射劑，有少量口服制劑，如去氨加壓素、利那洛肽、索瑪魯肽等，有少量吸入制劑如去氨加壓素、鮭降鈣素等。本文主要結合《化學藥品注射劑仿制藥質量和療效一致性評價技術要求( 征求意見稿) 》對多肽類藥物注射劑與小分子化藥存在的潛在差異進行重點討論。
5.1 處方工藝方面
輔料選擇問題: 盡管藥監部門允許注射劑仿制藥在抑菌劑、緩沖劑、pH 值調節劑、抗氧劑、金屬離子絡合劑等與參比制劑存在差異，但對于多肽制劑而言，所選擇輔料應盡可能與參比制劑一致，主要原因有: 肽鏈的穩定性較差，酸、堿、金屬離子等可能引起肽鏈降解; 肽類藥物結構中存在多個裸露的氨基與羧基，可能會與輔料相互作用，形成相關的雜質; 多肽類藥物可能存在高級結構，細微的pH 值、離子強度的差異可能引起結構的變化。
配液過程: 部分多肽類藥物對溶液pH 值、氧含量、離子強度等敏感，在配制過程中，短時間脫離穩定環境，會給多肽類藥物造成不良影響。對工藝細節的把握則更加關鍵，需對原輔料加入順序、攪拌時間、攪拌速度、是否需要避光除氧等進行詳細的考察，確定是否對產品質量造成影響。
如某多肽制劑，前期工藝開發過程中發現該藥物在相對較窄的pH 值范圍內穩定，擬定關鍵工藝參數pH 值控制范圍也相對較窄。在首次工藝驗證中發現，配液之后pH 值在擬定控制范圍內，但所制備部分終產品pH 值已超出擬定控制范圍。主要原因是批量放大后，商業生產設備的攪拌性能低，多肽類藥物的溶解時間延長，藥物配置后pH 值需在較長時間后達到穩態。對攪拌速度、時間等工藝參數進行詳細考察后，實現了連續3 批產品的穩定生產。
如某多肽制劑，3批工藝驗證產品在12 個月穩定性留樣時，一批產品雜質增加幅度明顯較另2 批大，經審查實際批生產記錄時發現，變化較大批次產品存在pH 值回調問題。由于該產品工藝是將原料藥加入調好pH 值的溶液中，回調之后體系離子強度增加，初步判斷是造成該降解現象的主要原因。申請人的補充研究顯示，如果體系中離子強度增加，加速試驗可明顯發現藥物降解速度增加，因此在工藝規程中進行了嚴格的限定，如pH 值調節失敗，直接作為廢液處理，重新生產。
凍干工藝問題: 多肽類藥物受穩定性限制，采用注射給藥途徑時多選擇凍干注射劑。從申報資料來看，多數申請人僅以可凍干為目的開展研究，忽視凍干工藝對穩定性的影響。由于藥物在凍干過程中可能存在緩沖劑結晶、pH 值位移、穩定劑形態改變、多肽空間構象改變等諸多問題，進而可直接影響多肽類藥物的穩定性。如某進口多肽制劑，擬定凍干工藝需40 ℃保持較長時間，由于藥物擬定貯藏條件是2 ～ 8 ℃保存，因此在審評過程中對該過程提出疑問，要求申請人進一步提供凍干工藝的合理性。申請人提供了不同凍干工藝條件下產品穩定性的比較數據，結果顯示二次升溫階段采用較高溫度時，產品長期放置過程中降解雜質明顯少于全程均在低溫條件下凍干的產品。該過程可認為是凍干工藝中的“退火”，可以起到釋放藥物能量、改善微觀結構等作用，進而達到進一步穩定多肽類藥物的目的。美國Michael Pikal 教授在該方面進行了深入研究［6］，可指導多肽類藥物凍干工藝的開發。
特殊包裝形式問題: 部分降糖藥物采用卡式瓶預灌封技術，該類藥物由于制備工藝和使用方法的特殊性，需建立特別的研究手段。如卡式瓶在生產過程中一般需硅化處理，硅化步驟直接影響內壁的光滑程度，進而影響給藥劑量的準確性。應對硅油噴涂量、均勻性等進行相應的控制; 由于給藥方式的特殊性，如制劑中含有氣泡，會導致對壓力反應的不一致，直接引起給藥劑量不準確，可在灌裝過程中采取多次注入的方式以減少氣體的引入; 該類藥物涉及多次刺穿等問題，需對包材密封性進行完整的考察。
相容性問題: 部分多肽類藥物對生產設備可能引入的金屬雜質較敏感，微量雜質的引入可能引起肽鏈降解，導致仿制品的降解速度快于參比制劑。開展藥物與生產設備、濾器、藥物包材的相容性研究時，在小分子化藥關注研究內容的基礎上，研究者應提高對金屬離子等無機雜質的關注度。另外，多肽類藥物給藥劑量通常較小，為了保證藥物劑量的準確性，需要關注生產設備、濾器、包材對藥物的吸附，必要時可采用過量投料的方式予以解決，但應提供充分依據。
如某多肽制劑，申請人在前期開發中發現擬定生產設備可引入金屬離子，導致產品降解速率明顯加快。由于生產設備更換難度較大，申請人擬定配液工序使用一次性配液袋，避免了金屬離子的引入，進而保證了產品質量。
專屬溶媒、注射器問題: 部分多肽參比制劑有專屬溶媒、專屬注射器具，仿制藥企業在開展研究時，需要關注藥物是否與臨床通用配伍溶媒、注射器存在相容性問題，應充分評估專屬溶媒、注射器的必要性。
如特利加壓素參比制劑，具有專屬溶劑氯化鈉水溶液，產品質量標準附錄中對氯化鈉水溶液中氯化鈉濃度和pH 值等做了較詳細的限定，目前臨床通用的配伍溶劑不滿足參比制劑擬定控制限度要求。國內上市的注射用特利加壓素均未明確臨床配伍溶劑，因此在后續一致性評價等研究中需評估專屬溶劑的必要性及配伍使用過程中對產品質量及患者耐受性等多方面的影響。
5.2 質量研究方面
研究者應結合多肽藥物的自身特點，在質量研究中進行針對性考察。對于穩定性差的多肽類藥物，應關注pH 值、性狀、復溶時間、初始雜質水平等是否與參比制劑一致?？赡軙嬖谫|量標準控制限度較寬，仿制品可滿足擬定質量標準要求，但與參比制劑相比仍存在一定差異的現象。
研究者應結合多肽藥物的自身特點，在質量研究中進行針對性考察。對于穩定性差的多肽類藥物，應關注pH 值、性狀、復溶時間、初始雜質水平等是否與參比制劑一致?？赡軙嬖谫|量標準控制限度較寬，仿制品可滿足擬定質量標準要求，但與參比制劑相比仍存在一定差異的現象。
有關物質是多肽類藥物制劑質量研究的重點項目之一，制劑質量研究應結合原料藥有關物質考察結果，關注對降解雜質的考察，需要重點關注聚合物雜質。多肽含有二硫鍵、裸露的氨基和羧基等，很容易因分子間二硫鍵或氨基羧基間的脫水形成聚合物。
研究者應明確高分子雜質是由共價鍵形成的聚合物、分子間力形成的聚集體還是肽鏈固定的高級結構。如是共價鍵形成的聚合物，則可能存在較大免疫原性風險，應確定與參比制劑中該雜質的結構一致性，并確保其含量在安全的限度以內。
5.3 穩定性問題
在對多肽類藥物開展穩定性考察時，除常規考察項目外，應重點關注配伍穩定性研究，主要原因是多肽類藥物多在溶液狀態下穩定性較差，配伍穩定性更能體現出與參比制劑的質量差別。部分多肽類藥物如按臨床實際使用藥液濃度，需稀釋較大倍數，按擬定質量標準中分析方法可能無法檢測出產品真實的質量變化情況。必要時可降低配伍溶液使用量，與參比制劑在相同的配伍濃度下進行穩定性比較，證明仿制品質量不低于參比制劑。
應該重視的是，目前國內上市的部分多肽類仿制藥物的貯藏條件比參比制劑更加苛刻，如卡貝縮宮素，參比制劑貯藏條件為不超過30 ℃，不能凍存。國產仿制藥貯藏條件為密閉，2～ 8 ℃保存。貯藏條件的差異提示產品的穩定性可能存在差異，進一步探討可能是由多肽仿制藥的原料藥、處方、生產工藝、生產設備、包裝容器等綜合原因所致。上述問題體現仿制藥質量未能達到與參比制劑一致，需要提升和改進質量，穩定性應與參比制劑一致，貯藏條件原則上應不比參比制劑苛刻。
6.結語
由于多肽類藥物是介于小分子化學藥物和蛋白藥物之間的一類特殊制劑，盡管研究開發存在一定困難，在對藥物風險充分識別的基礎上，建立相應的控制措施，可有效保障產品質量。
中國新藥雜志 2020 年 第 29 卷 第 8 期 作者 胡玉璽，韓天嬌，胡延臣 國家藥品監督管理局藥品審評中心 北京大學藥學院 天然藥物及仿生藥物 國家重點實驗室 聲明：引光醫藥對本文觀點保持中立。文章僅供交流學習使用，版權歸原作者所有，如遇版權問題請與我們聯系（Email：HR@YGMED.CN）
